Определение молекулярно-массового распределения для гепаринов низкомолекулярных (подлинность методом эксклюзионной хроматографии)
1. Гепарины низкомолекулярные – программное обеспечение
2. Методика определения молекулярно-массового распределения для гепаринов низкомолекулярных
3. Стажировки на базе ГП «Фармакопейный центр»
1. Гепарины низкомолекулярные – программное обеспечение
ГП «Фармакопейный центр» разработано программное обеспечение (ПО), предназначенное для определения молекулярно – массового распределения для гепаринов низкомолекулярных в соответствии с методикой Европейской фармакопеи / Государственной Фармакопеи Украины 01/2008:0828 «Heparins, low-molecular-mass» (Гепарины низкомолекулярные).
ПО разработано на лицензионно-чистой базе (Java).
По запросу Заказчика ПО конфигурируется на выполнение всех необходимых расчетов для любых гепаринов низкомолекулярных. Например, для анализа эноксапаринов проводятся расчеты:
- МW;
- Процентное содержание фракции с молекулярной массой менее 2000;
- Процентное содержание фракции с молекулярной массой от 2000 до 8000;
- Дополнительно в соответствии с требованиями фармакопеи США: Процентное содержание фракции с молекулярной массой более 8000;
Рис.1. Закладка ПО «Идентификация» – пример расчетов молекулярно-массовых характеристик для референтного препарата Клексан (эноксапарин натрия, фирма-производитель Санофи – Авентис).
По запросу Заказчика ПО настраивается под формат данных, который генерирует используемая Заказчиком система обработки данных. Например, ПО читает форматы данных хроматографов фирм Waters, Agilent, Shimadzu. Возможна настройка под другие форматы данных. Требование к системе обработки хроматограмм Заказчика – хроматограммы должны экспортироваться в открытом формате.
В ПО визуализован процесс калибровки. Это позволяет легко выбирать корректный диапазон времен удерживания, в котором для данной хроматографической системы необходимо проводить калибровку, и контролировать качество калибровки.
Желательно, чтобы диапазон калибровки был как можно более широким. При этом результат калибровки будет максимально объективным. Однако если использовать максимально широкий диапазон (т.е. весь диапазон для ненулевого сигнала двух синхронизованных хроматограмм УФ-детектора и рефрактометрического детектора), это приводит к искажениям калибровки. Для проведения корректной калибровки необходимо, чтобы функция, которой описывается калибровка, имела S-образный вид, который соответствует физической природе калибровки для эксклюзионной хроматографии (см. рисунок 2).
Рис. 2. Вид калибровочной функции при правильно выбранном диапазоне калибровки. В нижнем окне экрана розовая линия – рассчитанная методом наименьших квадратов калибровочная функция; на нее наложены фактические результаты из хроматограмм для калибровки (черные точки).
Отсечена часть высокомолекулярного диапазона, в котором калибровка неадекватна (рис. 3), и часть низкомолекулярного диапазона, в который попадают пики, которые не являются гепаринами низкомолекулярными (рис. 3).
Рис. 3. Для тех же хроматограмм вид калибровочной функции при неправильно выбранном диапазоне калибровки (для максимального диапазона).
Как видно, неправильно выбранный диапазон может приводить даже к «переворачиванию» калибровочной функции, что трудно заметить без визуализации калибровки. ПО позволяет также контролировать степень соответствия калибровочной функции экспериментальным данным статистически по остаточному стандартному отклонению (S0). Можно видеть, что для корректного диапазона калибровки (рис. 2) S0 составляло 0.055, а для максимального диапазона 0.69 (рис. 3), т.е. на порядок выше.
2. Методика определения молекулярно-массового распределения для гепаринов низкомолекулярных
ГП «Фармакопейный центр» на основе методики Европейской фармакопеи разработана методика идентификации гепаринов низкомолекулярных по показателям молекулярно-массового распределения.
Методика позволяет проводить определение ММР как в субстанции, так и в готовых лекарственных средствахгепаринов низкомолекулярных.
Рис. 4. Хроматограмма препарата Клексан (эноксапарин натрия, Санофи – Авентис), полученная в условиях методики Европейской фармакопеи для идентификации гепаринов низкомолекулярных методом эксклюзионной хроматографии.
Как можно видеть на рисунке, задний фронт пика эноксапарина обрезан системным пиком на высоте около 20% от максимума пика. Это делает сомнительным корректное определение в данных условиях параметров молекулярно-массового распределения эноксапарина.
Рис. 5. Хроматограмма препарата Клексан, полученная в условиях методики, разработанной ГП «Фармакопейный центр» для идентификации гепаринов низкомолекулярных методом эксклюзионной хроматографии (для той же хроматографической системы).
Как видно из рисунка, пик эноксапарина в препарате разделен до базовой линии, что обеспечивает корректное определение молекулярно-массовых характеристик.
В разработанной методике решены следующие проблемы:
– дано указание по использованию маркера для синхронизации хроматограмм (не отражено в методике Европейской фармакопеи);
– оптимизировано использование стандартного образца ЕФ для калибровки (возможно использование одной упаковки для 5 анализов вместо одного анализа);
– проведена валидация методики, включая изучение максимальных сроков годности раствора для калибровки и испытуемых растворов в указанных условиях хранения;
– разработан детальный тест на пригодность хроматографической системы (включает параметры контроля линейного дрейфа базовой линии и долговременных флуктуаций базовой линии при выполнении анализа);
– введена регламентация округления полученных результатов определения молекулярно-массового распределения, что важно для принятия решения о качестве анализируемого образца;
– научно обоснованы и валидированы метрологические критерии контроля получаемых результатов (исходя из принципа незначимости ГФУ, Валидация аналитических методик и испытаний) – требования к варьированию двух параллельных определений для всех молекулярно-массовых характеристик. Например, для эноксапарина нормируется максимально допустимое различие для двух параллельных результатов:
- MW;
- для процентного содержания фракции с молекулярной массой менее 8000;
- для процентного содержания фракции с молекулярной массой от 2000 до 8000;
- для разработанной методики предлагается проведение ее верификация в лаборатории заказчика (экспериментальное подтверждение того, что в данной лаборатории для данного лабораторного окружения – оборудование, реактивы, персонал и др., методика воспроизведена корректно и дает приемлемые результаты). Данная методика ММР очень специфическая, и в литературе практически отсутствуют рекомендации по ее верификации, которая была разработана ГП Фармакопейный центр.
3. Стажировки на базе ГП «Фармакопейный центр»
Выполнение данного анализа требует специального опыта хроматографиста. Например, в некоторых случаях требуется весьма специфическое интегрирование хроматограммы (проведение общей базовой линии для всей группы пиков и затем «отсечение» фракции группы пиков, которая не должна участвовать в расчете ММР).
На базе ГП «Фармакопейный центр» возможно проведение стажировок по обучению проведению анализа гепаринов низкомолекулярных. Предлагается выполнить анализ референтных препаратов, а также образцов заказчика, в анализе которых он заинтересован.
Заказчику предоставляется официальный сертификат анализа и первичные данные (хроматограммы).
На базе ГП «Фармакопейный центр» проводится обучение по выполнению анализа (хроматографическая часть) и по использованию для обсчета программного обеспечения.
От ГП «Фармакопейный центр» выдается Сертификат подтверждения квалификации стажера.
Предположительная продолжительность стажировки 4 – 7 дней (в зависимости от объема работ и квалификации стажера).