Визначення молекулярно-масового розподілу для гепаринів низькомолекулярних (справжність методом ексклюзіонной хроматографії)

1. Гепарини низькомолекулярні – програмне забезпечення.

2. Методика визначення молекулярно-масового розподілу для гепаринів низькомолекулярних.

3. Стажування на базі ДП «Фармакопейний центр».

 

1. Гепарини низькомолекулярні – програмне забезпечення

ДП «Фармакопейний центр» розроблено програмне забезпечення (ПЗ), призначене для визначення молекулярно – масового розподілу для гепаринів низькомолекулярних у відповідності з методикою Європейської фармакопеї / Державної Фармакопеї України 01/2008: 0828 «Heparins, low-molecular-mass» (гепарини низькомолекулярні).

ПО розроблено на ліцензійно-чистої базі (Java).

За запитом Замовника ПО конфігурується на виконання всіх необхідних розрахунків для будь-яких гепаринів низькомолекулярних. Наприклад, для аналізу еноксапарину проводяться розрахунки:

  • МW;
  • Процентний вміст фракції з молекулярною масою менше 2000;
  • Процентний вміст фракції з молекулярною масою від 2000 до 8000;
  • Додатково відповідно до вимог фармакопеї США: Процентний вміст фракції з молекулярною масою більше 8000;

Рис.1. Закладка ПЗ«Ідентифікація» – приклад розрахунків молекулярно-масових характеристик для референтного препарату Клексан (еноксапарин натрію, фірма-виробник «Санофі-Авентіс»).

За запитом Замовника ПЗ настроюється під формат даних, який генерує використовувана Замовником система обробки даних. Наприклад, ПЗ читає формати даних хроматографів фірм Waters, Agilent, Shimadzu. Можливе налаштування під інші формати даних. Вимога до системи обробки хроматограм Замовника – хроматограми повинні експортуватися у відкритому форматі.

У ПЗ візуалізований процес калібрування. Це дозволяє легко вибирати коректний діапазон часів утримування, в якому для даної хроматографічної системи необхідно проводити калібрування, і контролювати якість калібрування.

Бажано, щоб діапазон калібрування був якомога ширшим. При цьому результат калібрування буде максимально об'єктивним. Проте, якщо використовувати максимально широкий діапазон (тобто весь діапазон для ненульового сигналу двох синхронізованих хроматограм УФ-детектора і рефрактометричного детектора), це призводить до спотворень калібрування. Для проведення коректного калібрування необхідно, щоб функція, яка описує калібрування, мала S-подібний вигляд, який відповідає фізичній природі калібрування для ексклюзійної хроматографії (див. рисунок 2).

Рис. 2. Вид калібрувальної функції при правильно вибраному діапазоні калібрування. У нижньому вікні екрану рожева лінія – розрахована методом найменших квадратів калібрувальна функція; на неї накладені фактичні результати з хроматограм для калібрування (чорні точки).

Відсічена частина високомолекулярного діапазону, в якому калібрування неадекватне (рис. 3), і частина низькомолекулярного діапазону, в яку потрапляють піки, які не є гепаринами низькомолекулярними (рис. 3).

Рис. 3. Для тих же хроматограм вид калібрувальної функції при неправильно вибраному діапазоні калібрування (для максимального діапазону).

Як видно, неправильно вибраний діапазон може призводити навіть до «перевертання» калібрувальної функції, що важко помітити без візуалізації калібрування. ПЗ дозволяє також контролювати ступінь відповідності калібрувальної функції експериментальним даним статистично за залишковим стандартним відхиленням (S0). Можна бачити, що для коректного діапазону калібрування (рис. 2) S0 становило 0.055, а для максимального діапазону 0.69 (рис. 3), тобто на порядок вище.

2. Методика визначення молекулярно-масового розподілу для гепаринів низькомолекулярних

ДП «Фармакопейний центр» на основі методики Європейської фармакопеї розроблено методику ідентифікації гепаринів низькомолекулярних за показниками молекулярно-масового розподілу.

Методика дозволяє проводити визначення ММР як в субстанції, так і в готових лікарських засобах гепаринів низькомолекулярних.

Рис. 4. Хроматограма препарату Клексан (еноксапарин натрію, Санофі-Авентіс), отримана в умовах методики Європейської фармакопеї для ідентифікації гепаринів низькомолекулярних методом ексклюзійної хроматографії.

Як можна побачити на рисунку, задній фронт піку еноксапарину обрізаний системним піком на висоті близько 20 % від максимуму піка. Це робить сумнівним коректне визначення в даних умовах параметрів молекулярно-масового розподілу еноксапарину.

Рис. 5. Хроматограма препарату Клексан, отримана в умовах методики, розробленої ДП «Фармакопейний центр» для ідентифікації гепаринів низькомолекулярних методом ексклюзійної хроматографії (для тієї ж хроматографічної системи).

Як видно з рисунка, пік еноксапарину в препараті роздільний до базової лінії, що забезпечує коректне визначення молекулярно-масових характеристик.

У розробленій методиці вирішені наступні проблеми:

  • Дано вказівку щодо використання маркера для синхронізації хроматограм (не відображено в методиці Європейської фармакопеї);
  • Оптимізовано використання стандартного зразка ЄФ для калібрування (можливе використання однієї упаковки для 5 аналізів замість одного аналізу);
  • Проведена валідація методики, які включають вивчення максимальних термінів придатності розчину для калібрування і випробуваних розчинів в зазначених умовах зберігання;
  • Розроблено детальний тест на придатність хроматографічної системи (включає параметри контроль лінійного дрейфу базової лінії і довготривалих флуктуацій базової лінії при виконанні аналізу);
  • Введена регламентація округлення отриманих результатів визначення молекулярно-масового розподілу, що важливо для прийняття рішення про якість аналізованого зразка;
  • Науково обґрунтовані та валідовані метрологічні критерії контролю одержуваних результатів (виходячи з принципу незначущості ДФУ, валідації аналітичних методик і випробувань) – вимоги до варіювання двох паралельних визначень для всіх молекулярно-масових характеристик. Наприклад, для еноксапарину нормується максимально допустиме розходження для двох паралельних результатів:
  • MW;
  • Для процентного вмісту фракції з молекулярною масою менше 8000;
  • Для процентного вмісту фракції з молекулярною масою від 2000 до 8000;
  • Для розробленої методики пропонується проведення її верифікація в лабораторії замовника (експериментальне підтвердження того, що в даній лабораторії для даного лабораторного оточення – обладнання, реактиви, персонал та ін., методика відтворена коректно і дає прийнятні результати). Дана методика ММР дуже специфічна, і в літературі практично відсутні рекомендації щодо її верифікації, яка була розроблена ДП «Фармакопейний центр».

3. Стажування на базі ДП «Фармакопейний центр»

Виконання даного аналізу вимагає спеціального досвіду хроматографіста. Наприклад, в деяких випадках потрібне вельми специфічне інтегрування хроматограми (проведення загальної базової лінії для всієї групи піків і потім «відсікання» фракції групи піків, яка не повинна брати участь у розрахунку ММР).

На базі ДП «Фармакопейний центр» можливе проведення стажувань з навчання проведенню аналізу гепаринів низькомолекулярних. Пропонується виконати аналіз референтних препаратів, а також зразків замовника, в аналізі яких він зацікавлений.

Замовнику надається офіційний сертифікат аналізу та первинні дані (хроматограми).

На базі ДП «Фармакопейний центр» проводиться навчання щодо виконання аналізу (хроматографічна частина) і використання для обрахунку ПЗ.

Від ДП «Фармакопейний центр» видається Сертифікат підтвердження кваліфікації стажору.

Можлива тривалість стажування 4-7 днів (в залежності від обсягу робіт та кваліфікації стажора).